|
|
Study of Genotoxicity of Organic Compounds Using DNA Biosensors
Augustín, Michal ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Trnková, Libuše (oponent) ; Labuda, Ján (oponent)
Navržená disertační práce představuje nové hybridní elektrochemické DNA biosenzory založené na odlišných formách pyrolytického grafitu ("edge-plane" a "basal-plane") a jejich potenciál z hlediska použitelnosti v oblasti elektrochemie DNA. Testování použitelnosti prezentovaných bioanalytických nástrojů předcházel důkladný optimalizační proces zahrnující výběr optimálních hodnot pro nejdůležitější provozní parametry elektrochemických DNA biosenzorů připravených pomocí elektrostatické adsorpce - depoziční potenciál (Edep), doba depozice (tdep), optimální koncentrace DNA pro elektrostatickou adsorpci (cg(DNA)) a možné zapojení konvekce během adsorpčního procesu. Nejprve byla zkoumána použitelnost prezentovaných bioanalytických nástrojů ve vztahu ke sledování poškození DNA s využitím tripletu externích zdrojů poškozujících DNA - UV záření, jednoelektronových oxidantů nebo hydroxylových radikálů. Výsledky poškozujících procesů byly sledovány přímo (prostřednictvím sledování změn redoxních signálů DNA) nebo nepřímo (prostřednictvím sledování změn redoxních signálů redoxního indikátoru) a to za pomoci voltametrických metod - square-wave voltametrie (SWV), cyklická voltametrie (CV), lineární voltametrie (LSV) a elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS). Dále byla hodnocena použitelnost navrženého...
|
|
|
Voltammetric Determination of DNA Damage Caused by Genotoxic 2-Aminofluorene at a Carbon Film Electrode
Faťarová, Mária ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Zima, Jiří (oponent)
Velkoplošná uhlíková filmová elektroda (ls-CFE) představuje vhodnou alternativu ke komerčně dostupným jednorázovým sítotiskovým uhlíkovým pracovním elektrodám. Jejími hlavními výhodami jsou její jednoduchá, rychlá a levná příprava, jednoduchá mechanická obnova elektrodového povrchu (otřením starého filmu o filtrační papír a vytvořením filmu nového), dobrá reprodukovatelnost měření, odstranění problémů spojených s " historií elektrody" a jednoduchá chemická modifikace. V této bakalářské práci je ls-CFE použita k přípravě jednoduchého elektroche- mického DNA biosenzoru pro detekci karcinogenního environmentálního polutantu - 2-aminofluorenu (2-AF). Složení suspenze uhlíkového inkoustu bylo optimalizováno a testováno pomocí redoxního systému Fe2+ /Fe3+ užitím cyklické voltametrie. Vel- koplošná pevná elektroda pokrytá uhlíkovým filmem o optimálním složení byla tes- tována jako přenašeč elektronického signálu pro přípravu (pomocí dvouvláknové DNA (dsDNA)) elektrochemického DNA biosenzoru (dsDNA/ls-CFE). Elektrochemické chování dsDNA přítomné v měřeném základním elektrolytu (octa- nový pufr o pH 4,7 a koncentraci 0,1 mol.L−1) nebo navázané na povrchu ls-CFE (na- nesením zásobního roztoku dsDNA a...
|
|
|
Působení genotoxického 2-nitrofluorenu a jeho metabolitů na DNA in vivo a možnosti výzkumu tohoto působení pomocí elektrochemických DNA biosenzorů in vitro
Stávková, Klára ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Předkládaná bakalářská práce se zaměřuje na problematiku nebezpečného 2-nitrofluorenu (NF), který je jedním z markerů výskytu nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků. Shrnuje dosavadní poznatky o vzniku tohoto xenobiotika, jeho výskytu a koloběhu v životním i pracovním prostředí a negativních účincích na živé organismy, především pak na jejich DNA. Tyto poznatky z in vivo studií jsou v předkládané bakalářské práci porovnány s informacemi získanými pomocí elektrochemických DNA biosenzorů, které představují velmi slibnou in vitro alternativu studia dějů probíhajících v živých organismech při interakci xenobiotik s jejich DNA. NF se do ovzduší uvolňuje převážně výfukovými plyny z dieslových i benzínových motorů. Adsorbuje se na pevné prachové částice, pomocí kterých se rozšiřuje na velké vzdálenosti a vstupuje do dýchacích cest živočichů. Atmosférickým spadem přechází NF do vody a půdy, kde je spolu s dalšími živinami a potravou přenášen do rostlin a živočichů a jejich konzumací se poté dostává do těl vyšších živočichů i člověka. Bylo ukázáno, že NF je chemicky stabilní látkou, avšak v organismu podléhá intenzivnímu metabolismu. Metabolity vykazují mutagenní i karcinogenní účinky. Nejnebezpečnějším se jeví 2-acetylaminofluoren. Váže se na DNA a vytváří s ní DNA adukty, které mohou iniciovat...
|
|
|
Jednoduchý elektrochemický DNA biosenzor pro detekci poškození DNA způsobeného UV zářením
Arustamian, Daria ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Dejmková, Hana (oponent)
Ultrafialové (UV) záření je běžným činidlem poškozujícím DNA. Hlavní léze DNA, jako jsou cyklobutanové pyrimidinové dimery (CPD) a pyrimidin-(6-4)-pyrimidonové ((6-4)PP) fotoprodukty, jsou karcinogenní a mutagenní. Poškození DNA způsobené UV zářením bylo sledované pomocí jednoduchého elektrochemického DNA biosenzoru na bází elektrody z ultračistého grafitu (UTGE) a nízkomolekulární dvouvláknové DNA (dsDNA) z lososích spermií. Biosenzor byl připraven adsorpcí dsDNA na povrch UTGE a následně použit pro detekci poškození dsDNA způsobeného UV zářením. Zkoumaní vlivu UV záření na dsDNA bylo provedeno pomocí kombinace několika elektrochemických technik: square-wave voltametrie pro přímé sledování oxidace DNA bází a cyklické voltametrie (CV) a elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS), jako nepřímých elektrochemických metod, s použitím redoxního indikátoru [Fe(CN)6]4-/3- . Optimalizace přípravy dsDNA/UTGE biosenzoru probíhala metodami CV a EIS, které umožňují charakterizovat povrch elektrody. Připravený dsDNA/UTGE biosenzor byl vystaven UV záření, jež bylo generováno pomocí UV lampy se dvěma nestanovitelnými vlnovými délkami: UVC při 254 nm a UVA při 365 nm. UVC záření bylo použito pro poškození DNA. Pokles signálu o 50 % byl zaznamenán po 20 minutách expozice UVC záření. UVA záření bylo použito pro...
|
|
|
Elektrochemický výzkum nových redoxních indikátorů pro detekci poškození DNA
Otépka, Tomáš ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Fischer, Jan (oponent)
Cílem této práce bylo zkoumání nových redoxních systémů, které by bylo možné využít pro detekci poškození DNA na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě (m-AgSAE). Jako slibné se nabízely komplexy 1,10-fenantrolinu (phen) a iontů přechodných kovů. Konkrétně byly provedeny pokusy s komplexy kobaltaných iontů a phen, jejichž příprava byla provedena slitím roztoků obou složek v příslušném poměru. Chování komplexů v této směsi bylo porovnáno se syntetizovaným komplexním kationtem [Co(phen)3]3+ , a to jednak s využitím voltametrické techniky, jednak spektrofotometricky pomocí UV/VIS spektrofotometrie. Analýzy na m-AgSAE probíhaly s využitím techniky diferenční pulsní voltamerie (DPV) ve vodném prostředí. Jako základní elektrolyt byl zvolen 0,1 mol.dm-3 KCl, který poskytoval nejširší potenciálové okno v katodické oblasti potenciálů. Nízkomolekulární DNA z lososího spermatu byla využita v následujícím modifikační kroku pro vytvoření modifikované elektrody. Poškození DNA bylo provedeno vystavením takto připraveného biosenzoru UV-C záření o vlnové délce 254 nm. Poškozená DNA naadsorbovaná na m-AgSAE byla testována pomocí DPV v elektrochemické cele obsahující ionty Co2+ nebo komplex Co2+ a phen, obojí o koncentraci 1.10-3 mol.dm-3 . Na získaných voltamogramech byla sledována...
|
|
|
Jednoduchý elektrochemický DNA biosenzor pro detekci poškození DNA způsobeného UV zářením
Arustamian, Daria ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Dejmková, Hana (oponent)
Ultrafialové (UV) záření je běžným činidlem poškozujícím DNA. Hlavní léze DNA, jako jsou cyklobutanové pyrimidinové dimery (CPD) a pyrimidin-(6-4)-pyrimidonové ((6-4)PP) fotoprodukty, jsou karcinogenní a mutagenní. Poškození DNA způsobené UV zářením bylo sledované pomocí jednoduchého elektrochemického DNA biosenzoru na bází elektrody z ultračistého grafitu (UTGE) a nízkomolekulární dvouvláknové DNA (dsDNA) z lososích spermií. Biosenzor byl připraven adsorpcí dsDNA na povrch UTGE a následně použit pro detekci poškození dsDNA způsobeného UV zářením. Zkoumaní vlivu UV záření na dsDNA bylo provedeno pomocí kombinace několika elektrochemických technik: square-wave voltametrie pro přímé sledování oxidace DNA bází a cyklické voltametrie (CV) a elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS), jako nepřímých elektrochemických metod, s použitím redoxního indikátoru [Fe(CN)6]4-/3- . Optimalizace přípravy dsDNA/UTGE biosenzoru probíhala metodami CV a EIS, které umožňují charakterizovat povrch elektrody. Připravený dsDNA/UTGE biosenzor byl vystaven UV záření, jež bylo generováno pomocí UV lampy se dvěma nestanovitelnými vlnovými délkami: UVC při 254 nm a UVA při 365 nm. UVC záření bylo použito pro poškození DNA. Pokles signálu o 50 % byl zaznamenán po 20 minutách expozice UVC záření. UVA záření bylo použito pro...
|
|
|
Detekce oxidačního stresu pomocí elektrochemických DNA biosenzorů
Jurečková, Zuzana ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Fischer, Jan (oponent)
Předkládaná diplomová práce je zaměřena na vývoj, charakterizaci a využití jednoduchého a levného elektrochemického DNA biosenzoru pro detekci poškození DNA způsobeného oxidačním stresem. První část práce je věnována přípravě a charakterizaci velkoplošné uhlíkové filmové elektrody (ls-CFE) modifikované uhlíkovými nanotrubičkami (CNT/ls-CFE). Uhlíkové nanotrubičky zlepšují elektrochemické vlastnosti převodníku a zvyšují množství naadsorbované DNA na povrchu elektrody. Testování elektrodového povrchu modifikovaného vícestěnnými uhlíkovými nanotrubičkami (MWCNT) bylo provedeno pomocí cyklické voltametrie (CV) a elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS) s použitím redoxního systému [Fe(CN)6]4-/3- a square wave voltametrie (SVW) bez použití redoxního indikátoru. Uhlíkové nanotrubičky se ukázaly jako nevhodný materiál pro náš typ biosenzoru, ale je možné je využít v analytické chemii pro stanovování elektroaktivních látek. Druhá část práce se zabývá aplikací DNA biosenzoru při detekci poškození DNA oxidačním stresem. Byl zvolen biosenzor na bázi ls-CFE, jehož hlavní výhody jsou rychlá příprava, jednoduchá mechanická obnova elektrodového povrchu, dobrá reprodukovatelnost měření, absence problémů spojených s "historií elektrody". Oxidační stres vyvolaný galvanostaticky generovanými hydroxylovými...
|
|
|
Využití elektrochemického DNA biosenzoru při detekci poškození DNA způsobeného genotoxickým 2-nitrofluorenem
Stávková, Klára ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Zima, Jiří (oponent)
2-Nitrofluoren (NF) je považován za modelového zástupce nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků (NPAH) patřících do skupiny mutagenů a karcinogenů. Interakce DNA s genotoxickým 2-nitrofluorenem byla sledována pomocí elektrochemického DNA biosenzoru připraveného z elektrody ze skelného uhlíku (GCE) a nízkomolekulární DNA z lososích spermií. Použity byly techniky elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS), cyklická voltametrie (CV) a square-wave voltametrie (SWV). Za pomoci techniky EIS nebyla pozorována žádná poškozující interakce, která by způsobovala zlomy ve struktuře DNA. Pomocí CV byla ale zjištěna interkalace NF do struktury DNA za vzniku komplexu NF-DNA. Interkalace má za následek snížení počtu elektroaktivních míst schopných podléhat oxidaci, což bylo prokázáno technikou SWV, kdy docházelo ke snížení výšek píku guanosinu a adenosinu. Z důvodu nebezpečného působení NF na strukturu DNA byla vyvinuta elektroanalytická metoda pro jeho stanovení a aplikovatelnost metody byla úspěšně ověřena na modelovém vzorku písku. Pro vývoj byla použita technika diferenční pulsní voltametrie (DPV) v prostředí směsi Brittonova-Robinsonova purfu o pH 7,0 a ethanolu v poměru 7:3 (v/v) a s pravidelnou předúpravou povrchu elektrody. Mez stanovitelnosti (LQ) byla 1. 10-7 M.
|
|
|
Využití jednoduchého elektrochemického DNA biosenzoru při stanovení environmentálních polutantů a vyšetřování jejich interakce s DNA
Blašková, Marta ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Zima, Jiří (oponent)
Pomocí elektrochemického DNA biosenzoru na bázi elektrody ze skelného uhlíku (GCE) a nízkomolekulární DNA z lososích spermií (DNA/GCE) byla vyšetřována interakce DNA se třemi zástupci environmentálních polutantů - naftalenu, anthracenu a 2-aminoanthracenu. Interakce s DNA byly sledovány pomocí square wave voltametrie (SWV) a elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS). U naftalenu nebyla pozorována interakce poškozující DNA, v případě anthracenu byl pozorován vznik interkalačního komplexu [DNA-anthracen], jehož tvorba však nezpůsobuje vznik zlomů vláken DNA. Vznik podobného interkalačního komplexu byl pozorován i u 2-aminoanthracenu [DNA-2-aminoanthracen], u kterého se na základě získaných výsledků předpokládá, že interkalace 2-aminoanthracenu do dvoušroubovice DNA vyvolává pnutí a následný vznik jednořetězcových zlomů, které způsobují, že fragmenty DNA odpadávají z povrchu elektrody. Interkalační interakce DNA s anthracenem a 2-aminoanthracenem byla využita pro vývoj elektrochemických metod pro stanovení těchto látek na GCE a DNA/GCE. Při vývoji metod byly použity DC voltametrie (DCV) a diferenční pulzní voltametrie (DPV). Pro stanovení anthracenu byla vyvinuta DPV metoda využívající prostředí ethanol/Brittonův- Robinsonův (BR) pufr o pH 5,0 (1:1). Mez stanovitelnosti metody (LQ) na GCE byla...
|
|
|
Nový voltametrický DNA biosenzor pro detekci poškození DNA onkologickými léčivy
Hrochová, Zuzana ; Vyskočil, Vlastimil (vedoucí práce) ; Zima, Jiří (oponent)
Tato bakalářská práce je zaměřena na optimalizaci podmínek pro použití jednoduchého voltametrického DNA biosenzoru, založeného na velkoplošné uhlíkové filmové elektrodě (ls- CFE), při detekci poškození DNA onkologickými léčivy. ls-CFE byla použita pro svoje výhodné vlastnosti, mezi které patří její rychlá příprava, jednoduchá mechanická obnova elektrodového povrchu, dobrá reprodukovatelnost výsledků, jednoduchá chemická modifikace a v neposlední řadě nízké výrobní náklady. Hlavním optimalizačním parametrem v této práci byl obsah ethanolu v roztoku, ve kterém byl biosenzor inkubován spolu s poškozující látkou. Byly testovány obsahy ethanolu v rozmezí 0 až 50 % (V/V) ethanolu v 0,1 mol/l fosfátovém pufru o pH 7,15 (PBS). Měření po inkubaci biosenzoru byla prováděna pomocí cyklické voltametrie (CV) za přítomnosti redoxního indikátoru [Fe(CN)6]4-/3- v prostředí PBS. Jako optimální obsah ethanolu bylo zvoleno 5 %. Následně byl DNA biosenzor, jehož příprava byla již dříve optimalizována v předešlé bakalářské práci, využit při detekci poškození DNA modelovým cytostatikem - Elipticinem (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol). Pomocí techniky CV a redoxního indikátoru [Fe(CN)6]4-/3- byla proměřena odezva biosenzoru na poškození DNA přímou interakcí s Elipticinem v závislosti na čase inkubace a koncentraci...
|
host ::
RSS.